RTL omvänt transkriptas
RTL omvänt transkriptas är ett RNA-mallberoende DNA-polymeras som saknar 3'→5'-exonukleasaktiviteten och har RNas H-aktivitet.Detta enzym kan använda RNA som mall för att syntetisera en komplementär DNA-sträng, som kan appliceras på första-strängs cDNA-syntes, speciellt för RT-LAMP (loop-medierad isotermisk amplifiering).Jämfört med RTL omvänt transkriptas 1.0 är känsligheten signifikant förbättrad, den termiska stabiliteten är starkare och reaktionen vid 65°C är mer stabil.RTL omvänt transkriptas (glycerolfritt) kan användas för att framställa lyofiliserade preparat, lyofiliserade RT-LAMP-reagens etc.
Enhetsdefinition
En enhet inkorporerar 1 nmol dTTP i syrautfällbart material på 20 minuter vid 50°C med användning av poly(A)•oligo(dT)25 som mall-primer.
Komponenter
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL omvänt transkriptas (glycerolfri) (15 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL-buffert | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Lagringstillstånd
Transport under 0°C och förvaras vid -25°C~-15°C.
Kvalitetskontroll
- Restaktivitet avEndonukleas:En reaktion på 50 μL innehållande 1 μg λDNA och 15 enheter RTL2.0 inkuberad i 16 timmar vid 37 ℃ visar samma mönster som negativ kontroll med gelelektrofores.
- Restaktivitet avExonukleas:En reaktion på 50 μL innehållande 1 μg Hind Ⅲ digererad λDNA och 15 enheter RTL2.0 inkuberad i 16 timmar vid 37 ℃ visar samma mönster som negativ kontroll med gelelektrofores.
- Restaktivitet avNickase:En 50 μL reaktion innehållande 1 μg supercoiled pBR322 och 15 enheter RTL2.0 inkuberade i 4 timmar vid 37 ° C visar samma mönster som negativ kontroll genom gelelektrofores.
- Restaktivitet avRNase:En 10 μL reaktion innehållande 0,48 μg MS2 RNA och 15 enheter RTL2.0 inkuberad i 4 timmar vid 37 ° C visar samma mönster som negativ kontroll genom gelelektrofores.
- E coli gDNA:Mätt medE colispecifika HCD-detektionskit, 15 enheter av RTL2.0 innehåller mindre än 1E coligenomet.
Reaktionsinställningar
cDNA-syntesprotokoll
| Komponenter | Volym |
| Mall RNA a | frivillig |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) eller Random Primer-blandning (60uM) | 2 μL |
| dNTP-mix (10 mM vardera) | 1 μL |
| RNas-hämmare (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL-buffert | 2 μL |
| Nukleasfritt vatten | Upp till 20 μL |
Anmärkningar:
1) Den rekommenderade dosen av totalt RNA är 1ng~1μg
2) Den rekommenderade dosen av mRNA var 50 ng~100 ng
Termo-cykling Förutsättningar för en rutin reaktion:
| Temperatur (°C) | Tid |
| 25°Ca | 5 min |
| 55°C | 10 minb |
| 80°C | 10 min |
Anmärkningar:
1) Om Random Primer Mix används, ett inkubationssteg vid 25°C.
2) Om målprimerblandning används, ett inkubationssteg vid 55°C i 10~30 minuter.
RT-LAMP-protokoll
| Komponenter | Volym | Slutlig koncentration |
| Mall RNA | frivillig | ≥10 exemplar |
| dNTP-mix (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP Primers (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 Primers (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNas-hämmare (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaktion |
| RTL omvänt transkriptas 2.0 (15 U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Reaktion |
| Bst V2 DNA-polymeras (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaktion |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (totalt 8 mM) |
| 10×HC RTL-buffert (eller 10×HC Bst V2-buffert) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Nukleasfritt vatten | Upp till 25 μL | - |
Anmärkningar:
1) Blanda genom att vortexa och centrifugera kort för att samla upp.Konstant temperaturinkubation vid 65°C under 1 timme.
2) De två buffertarna är interoperabla och har samma sammansättning.
Anteckningar
1.Denna produkt kommer att bilda en vit fast substans när den förvaras vid -20 °C.Ta ut den från -20°C och lägg den på is i ca 10 minuter.Efter smältning kan den användas genom att skaka och blanda.
2. cDNA-produkten kan lagras vid -20°C eller -80°C eller användas omedelbart för PCR-reaktion.
3. För att förhindra RNase-kontamination, håll experimentområdet rent och bär rena handskar och masker under drift.
