Universal SYBR GREEN qPCR Premix (blå)
Kat.nr: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (Dye Based) är en förlösning för 2x realtids kvantitativ PCR-amplifiering kännetecknad av hög känslighet och specificitet, är blå till färgen och har effekten av provtillsatsspårning.Kärnkomponenten Taq DNA-polymeras använder antikroppsvarmstart för att effektivt hämma ospecifik amplifiering på grund av primer-annealing under provberedningen.Samtidigt lägger formeln till de främjande faktorerna för att förbättra amplifieringseffektiviteten för PCR-reaktionen och utjämna amplifieringen av gener med olika GC-innehåll (30 ~ 70%), så att kvantitativ PCR kan erhålla ett bra linjärt förhållande i en bred kvantitativ område.Denna produkt innehåller speciell ROX Passive Reference Dye, som är tillämpbar på de flesta qPCR-instrument.Det är inte nödvändigt att justera koncentrationen av ROX på olika instrument.Det är bara nödvändigt att lägga till primrar och mallar för att förbereda reaktionssystemet för amplifiering.
Komponenter
Universal Blue qPCR Master Mix
Förvaringsförhållanden
Produkten levereras med isförpackningar och kan lagras vid -25℃~-15℃ i 18 månader.Det är nödvändigt att undvika stark ljusbestrålning vid lagring eller förberedelse av reaktionssystemet.
Specifikation
| Koncentration | 2× |
| Detektionsmetod | SYBR |
| PCR-metod | qPCR |
| Polymeras | Taq DNA-polymeras |
| Typ av prov | DNA |
| Appliceringsutrustning | De flesta qPCR-instrument |
| Produkttyp | SYBR-premix för fluorescenskvantitativ PCR i realtid |
| Ansök till (ansökan) | Genexpression |
Instruktioner
1.Reaktionssystem
| Komponenter | Volome(μL) | Volome(μL) | Slutlig koncentration |
| Universal SYBR GREEN qPCR Premix | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2μmol/L |
| Reverse Primer (10μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2μmol/L |
| DNA | X | X | |
| ddH2O | upp till 50 | upp till 20 | - |
[Anmärkning]: Blanda noggrant före användning för att undvika alltför stora bubblor från kraftig skakning.
a) Primerkoncentration: Den slutliga primerkoncentrationen är 0,2 μmol/L och kan även justeras mellan 0,1 och 1,0 μmol/L efter behov.
b) Mallkoncentration: Om mallen är outspädd cDNA-stamlösning bör den använda volymen inte överstiga 1/10 av den totala volymen av qPCR-reaktionen.
c) Mallutspädning: Det rekommenderas att späda ut cDNA-stamlösningen 5-10 gånger.Den optimala mängden tillsatt mall är bättre när Ct-värdet som erhålls genom amplifiering är 20-30 cykler.
d) Reaktionssystem: Det rekommenderas att använda 20μL eller 50μL för att säkerställa effektiviteten och repeterbarheten av målgenamplifieringen.
e) Systemförberedelse: Vänligen förbered i den superrena bänken och använd spetsarna och reaktionsrören utan nukleasrester;det rekommenderas att använda spetsarna med filterpatroner.Undvik korskontaminering och aerosolkontamination.
2.Reaktionsprogram
Standardprogram
| Cykelsteg | Temp. | Tid | Cyklar |
| Initial denaturering | 95 ℃ | 2 min | 1 |
| Denaturering | 95 ℃ | 10 sek | 40 |
| Glödgning/förlängning | 60 ℃ | 30 sek★ | |
| Smältkurva skede | Instrumentets standardinställningar | 1 | |
Snabbprogram
| Cykelsteg | Temp. | Tid | Cyklar |
| Initial denaturering | 95 ℃ | 30 sek | 1 |
| Denaturering | 95 ℃ | 3 sek | 40 |
| Glödgning/förlängning | 60 ℃ | 20 sek★ | |
| Smältkurva skede | Instrumentets standardinställningar | 1 | |
[Notera]: Det snabba programmet är lämpligt för de allra flesta gener, och standardprogram kan testas för individuella komplexa sekundära strukturgener.
a) Glödgningstemperatur och tid: Justera efter längden på primern och målgenen.
b) Insamling av fluorescenssignal (★): Ställ in den experimentella proceduren enligt kraven i bruksanvisningen för instrumentet.
c) Smältkurva: Instrumentets standardprogram kan användas normalt.
3. Resultatanalys
Minst tre biologiska replikat krävdes för kvantitativa experiment.Efter reaktionen måste amplifieringskurvan och smältkurvan bekräftas.
3.1 Amplifieringskurva:
Standardförstärkningskurvan är S-formad.Kvantitativ analys är mest exakt när Ct-värdet faller mellan 20 och 30. Om Ct-värdet är mindre än 10 är det nödvändigt att späda mallen och utföra testet igen.När Ct-värdet är mellan 30-35 är det nödvändigt att öka mallkoncentrationen eller volymen av reaktionssystemet, för att förbättra amplifieringseffektiviteten och säkerställa noggrannheten i resultatanalysen.När Ct-värdet är större än 35 kan testresultaten inte kvantitativt analysera genens uttryck, utan kan användas för kvalitativ analys.
3.2 Smältkurva:
Den enda toppen av smältkurvan indikerar att reaktionsspecificiteten är god och kvantitativ analys kan utföras;om smältkurvan visar dubbla eller multipla toppar kan kvantitativ analys inte utföras.Smältkurvan visar dubbla toppar, och det är nödvändigt att bedöma om icke-måltoppen är primerdimer eller icke-specifik amplifiering genom DNA-agarosgelelektrofores.Om det är en primerdimer, rekommenderas att reducera primerkoncentrationen eller omdesigna primers med hög amplifieringseffektivitet.Om det är ospecifik amplifiering, vänligen öka hybridiseringstemperaturen eller omforma primrarna med specificitet.
Anteckningar
Vänligen använd nödvändig personlig skyddsutrustning, såsom labbrock och handskar, för att säkerställa din hälsa och säkerhet!
Denna produkt är ENDAST för forskningsanvändning!
