Plant direkt PCR Kit

Kat.nr: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit är lämpligt för direkt amplifiering av växtblad, frön etc. och kan användas för screening med hög genomströmning av växtprover som inte innehåller polysackarider och polyfenoler.Det direkta amplifierings-DNA-polymeraset baserat på den riktade utvecklingen har överlägsen tolerans mot PCR-hämmare i växter.Samtidigt bibehåller den den höga amplifieringsprestandan, som är lämplig för amplifiering av DNA-fragment inom 5 kb.Den unika lyseringsbufferten A i kitet kan användas för att lysera färska eller frysta växtvävnader.Det är lätt att använda och lysatet kan användas som mall för amplifiering utan rening.Systemet innehåller skyddsmedel som gör att råprover effektivt kan amplifieras efter upprepad frysning och upptining.2 × Plant Direct Master Mix behöver bara lägga till primers och mallar för att utföra amplifieringsreaktionen, vilket minskar pipettering och förbättrar detektionsgenomströmningen och reproducerbarheten av resultaten.

Komponenter

*Plant Direct Lysis Buffer B är ett valfritt reagens som används för att neutralisera Plant Direct Lysis Buffer A för att förlänga lagringstiden för prover.Den kan användas enligt den faktiska situationen.

Förvaringsförhållanden

2 × Plant Direct Master Mix, förvara vid -30 ~ -15 ℃ och undvik upprepad frysning och upptining;Plantera direkt lyseringsbuffert, lagra vid -30 ~ -15 ℃ eller 2 ~ 8 ℃.

Experimentprocess

Provbearbetning–Plantera Löv

Direkt metod:Det rekommenderas att använda unga blad.Använd en hålstans med en fast diameter på 0,5 – 3 mm för att få ett litet och enhetligt prov och lägg sedan till provet direkt i PCR-systemet (50 μl-system rekommenderas).Observera att provet är i PCR-lösningen och inte mot rörväggen.Om direkt PCR används för att amplifiera långa fragment och komplexa prover, kan användning av ett prov med en mindre diameter (0,5 – 1 mm) som mall hjälpa till att få bättre resultat.

Slipningslysmetod:Det rekommenderas att använda unga blad.Ta en liten bit blad (ca 1 – 3 mm i diameter), lägg den i 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab och mal den så mycket som möjligt (detta steg kan göras genom att klämma bladet med en 100 μl pipettspets att mosa provet).Om större volymer bladvävnad används (inte överstiger 7 mm), öka volymen spädningsbuffert till 50 μl.Efter att löven malts ska lösningen se grön ut.Efter en kort centrifugering, tillsätt 1 μl av supernatanten till PCR-systemet som en reaktionsmall.

Termisk lyseringsmetod:Det rekommenderas att använda unga blad.Ta en liten bit blad (ca 1 – 3 mm i diameter), placera den i 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A och värm den vid 95°C i 5 – 10 min.Lyseringstiden kan på lämpligt sätt förlängas för löv som är svåra att lysera (högst 20 min).Om större volymer bladvävnad används (inte överstiger 7 mm), öka volymen spädningsbuffert till 50 μl.Efter uppvärmning, centrifugera kort och tillsätt 1 μl supernatant till PCR-systemet som en reaktionsmall.

Provbearbetning– Växtfrö

Slipningslysmetod:Använd en skalpell för att skära frön med en diameter på 5 mm, tillsätt dem till 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A och mal provet med en pipettspets eller andra verktyg.Vortexa kort och låt stå i rumstemperatur i 3 – 5 min.Se till att fröprovet är nedsänkt i utspädningsbufferten.Efter en kort centrifugering, tillsätt 1 μl av supernatanten till PCR-systemet som en reaktionsmall.

Termisk lyseringsmetod:Använd en skalpell för att skära frön med en diameter på 5 mm, tillsätt dem till 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A och värm vid 95°C i 5 – 10 min.Lyseringstiden kan på lämpligt sätt förlängas för löv som är svåra att lysera (högst 30 min).Efter uppvärmning, centrifugera kort och tillsätt 1 μl supernatant till PCR-systemet som en reaktionsmall.

a.Sax eller andra verktyg kan också användas för att klippa prover av lämplig storlek;om stansen eller saxen återanvänds, bör de rengöras med 2 % natriumhypokloritlösning före varje användning för att förhindra korskontaminering mellan proverna.

b.Se till att Plant Direct Lysis Buffer är helt smält före användning.Om bufferten är trögflytande eller har fällningar kan den värmas till 37 ℃ för att smälta den helt före användning.

c.Templatvolymen i reaktionssystemet kan justeras på lämpligt sätt enligt skillnaden i volymen av växtmaterial och tillsatt utspädningsmedel.

Plant direkt lyseringsbuffert

Plant Direct Lysis Buffer A som finns i denna produkt har strikt optimerats för att frigöra genomet från de flesta växtvävnader och är lämplig för korttidslagring av råa växter vid 4 ℃.Om provet behöver förvaras under en längre tid (t.ex. 1 – 2 månader), rekommenderas det att överföra supernatanten till ett nytt EP-rör och förvara det vid -20 ℃.För att lagra proverna mer stabilt, tillsätt en lika stor volym Plant Direct Lysis Buffer B till den överförda supernatanten, blanda väl och förvara vid -20 ℃.Den stabila lagringstiden varierar med växtprover och tillstånd.

Reaktionssystem

a.Den innehåller Mg²⁺vid en slutlig koncentration av 2 mM.

b.Det rekommenderas att använda en slutkoncentration på 0,4μM för varje primer.Överdriven användning av primrar kommer att leda till ökad ospecifik amplifiering.

c.Mängden prov som används kan justeras efter den faktiska situationen.Mängden som används i en enstaka reaktion av rålyserat prov kan justeras mellan 2 % – 20 % av reaktionens totala volym.Användning av för mycket prover kan orsaka amplifieringsfel.

Reaktionsprogram

a.Initial denaturering (98 ℃, 5 min) främjar lys av växtvävnad och frigör genomiskt DNA som kan användas för PCR-amplifiering.Förkorta inte tiden eller sänk inte temperaturen.

b.Det rekommenderas att ställa in det lika med primerns Tm-värde eller 2 ~ 4℃ högre än Tm-värdet.Det direkta amplifierings-DNA-polymeraset som används i denna produkt skiljer sig från konventionellt Taq DNA-polymeras och har speciella krav på reaktionsglödgningstemperaturen; användningen av hög hybridiseringstemperatur kan effektivt minska ospecifik amplifiering och förbättra amplifieringseffektiviteten.För komplexa mallar kan den effektiva förstärkningen uppnås genom att justera glödgningstemperaturen och förlänga förlängningstiden.

c.Om längden på förstärkningsprodukten är ≤1 kb, sätts förlängningstiden till 30 sek/kb;om längden på amplifieringsprodukten är >1 kb, är förlängningstiden inställd på 60 sek/kb.

d.För komplexa prover eller prover med lågt amplifieringsutbyte kan antalet cykler på lämpligt sätt ökas till 40-50 cykler.

Ansökningar

Den är tillämpbar för direkt amplifiering av växtvävnader och screening med hög genomströmning av växtprover som inte innehåller polysackarider och polyfenoler.

Anteckningar

Endast för forskningsanvändning.Ej för användning i diagnostiska procedurer.

1. För rå växtamplifiering eller direkt amplifiering rekommenderas det att använda renat genomiskt DNA som en positiv kontroll innan experimentet påbörjas för att säkerställa att systemet, primrarna och operationerna är korrekta.

2. Det direkta amplifierings-DNA-polymeraset som används i detta kit har en stark korrekturläsningsaktivitet.Om TA-kloning behöver utföras, rekommenderas att rena DNA:t innan adenin tillsätts.

3. Grundläggande designvägledning:

a.Det rekommenderas att den sista basen vid 3′-änden av primern ska vara G eller C.

b.Konsekutiva felmatchningar bör undvikas i de sista 8 baserna vid 3′-änden av primern.c.Undvik hårnålsstrukturer i 3′-änden av primern.

d.Skillnader i Tm-värdet för den framåtriktade primern och den omvända primern bör inte vara mer än 1 ℃ och Tm-värdet bör justeras till 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 rekommenderas för att beräkna Tm-värdet).

e.Extra ytterligare primersekvenser som inte matchas med mallen ska inte inkluderas vid beräkning av primerns Tm-värde.

f.Det rekommenderas att GC-halten i primern är 40% -60%.

g.Den totala fördelningen av A, G, C och T i primern bör vara så jämn som möjligt.Undvik att använda regioner med högt GC- eller AT-innehåll.

h.Undvik närvaron av komplementära sekvenser av 5 eller fler baser antingen inom primern eller mellan två primers och undvik närvaron av komplementära sekvenser av 3 eller fler baser vid 3'-änden av två primers.

i.Använd NCBI BLAST-funktionen för att kontrollera primerns specificitet för att förhindra ospecifik amplifiering.