Superstart qPCR Premix plus-UNG
Kat.nr: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG är ett specialiserat reagens designat för realtids PCR kvalitativa och kvantitativa reaktioner med hjälp av sondbaserad detektion, utvecklad speciellt för lyofiliseringsprocesser.Den innehåller ett nytt hotstart-enzym Hotstart Taq plus (DG), som har sin Taq-enzymaktivitet förseglad vid rumstemperatur, vilket effektivt hämmar ospecifik amplifiering orsakad av ospecifik hybridisering av primer eller primerdimerbildning under lågtemperaturförhållanden, vilket förbättrar specificiteten för amplifieringsreaktionen.Detta reagens använder en optimerad qPCR-specifik buffert och UNG/dUTP antikontaminationssystem för att uppnå snabb varmstart, vilket avsevärt förbättrar effektiviteten och känsligheten för qPCR-reaktioner.Den kan erhålla bra standardkurvor inom ett brett spektrum av kvantifieringsområden och exakt utföra kvantifiering, vilket effektivt förhindrar falsk positiv amplifiering orsakad av kvarvarande PCR-produkter eller aerosolkontamination.Detta reagens är kompatibelt med de flesta fluorescerande kvantitativa PCR-instrument från tillverkare som Applied Biosystems, Eppendorf, BioRad och Roche etc., och uppvisar god stabilitet i lyofiliserad form.
Reagenssammansättning
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratis) (GD)
2. 250 mM MgCl2
3. 4×lyoskyddsmedel (valfritt)
Förvaringsförhållanden
Långtidsförvaring vid -20 ℃;kan förvaras vid 4 ℃ i upp till 3 månader.Blanda väl före användning ochundvik upprepad frysning och upptining.
Cykelprotokoll
| Procedur | Temp. | Tid | Cykel |
| Matsmältning | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Polymerasaktivering | 95 ℃ | 1~5 min | 1 |
| Denaturera | 95 ℃ | 10~20 s | 40-50 |
| Glödgning och förlängning | 56~64℃ | 20~60 s | 40-50 |
qPCR Liquid Reaction Systamberedning
|
Sammansättning |
25 µL volym |
50 µL volym |
Slutlig koncentration |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+gratis) (GD) | 5 µL | 10 µL | 1× |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µL | 0,9 µL | 4,5 mM |
| 4× lyoskyddsmedel1 | 6,25 µL | 12,5 µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Mall-DNA3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Till 25 µL | Till 50 µL | —— |
1. En slutlig koncentration på 0,2μM för primers ger vanligtvis goda resultat;när reaktionsprestanda är dålig, justera primerkoncentrationen inom intervallet 0,2-1μM efter behov.Sondkoncentrationen optimeras vanligtvis inom intervallet 0,1-0,3μM genom gradientexperiment för att hitta optimala kombinationer.
2. Antalet kopior av målgener som finns i olika typer av mallar varierar;vid behov kan gradientspädning utföras för att bestämma den optimala malltillsatsmängden.
3. Detta system kan lyofiliseras;när kunder använder detta system utan krav på frystorkning, kan 4× frystorkningsmedel tillsättas selektivt; om det krävs frystorkade produkter måste det under validering av produktprestanda i flytande reagenssteg tillsätta 4× frystorkningsmedel för att säkerställa överensstämmelse med de lyofiliserade systemkomponenterna och effekter.
När systemet användsd för frystorkning, förbered systemet as följande:
| Sammansättning | 25µL Reaktionssystem |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratis) (GD) | 5 µL |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µL |
| 4× lyoskyddsmedel | 6,25 µL |
| 25×Primer-Probe Mix | 1 µL |
| ddH2O | Till 18~20µL |
* Om andra system för frystorkning behövs, kontakta separat.
Lyofiliseringsprocedurss
| Procedur | Temp. | Tid | Skick | Tryck |
| Förfrysning | 4℃ | 30 minuter | Håll |
1 atm |
| -50 ℃ | 60 min | Kyl | ||
| -50 ℃ | 180 min | Håll | ||
| Primär torkning | -30℃ | 60 min | Uppvärmning |
Ultimat vakuum |
| -30℃ | 70 min | Håll | ||
| Sekundär torkning | 25℃ | 60 min | Uppvärmning |
Ultimat vakuum |
| 25℃ | 300 min | Håll |
2. Ovanstående lyofiliseringsprocess är endast för referens.Olika produkttyper och olika frystorkar har olika parametrar, så justeringar kan göras efter faktiskaförhållanden under användning.
3. Olika lyofiliseringsprocesser kan vara lämpliga för olika satsstorlekar av lyofiliseradeprodukter, så tillräcklig testvalidering måste utföras när de används för storskalig produktion.
Instruktion för användning av lyofiliserad pulver
1. Centrifugera kort det lyofiliserade pulvret;
2. Tillsätt nukleinsyramallen till det lyofiliserade pulvret och tillsätt vatten upp till 25 µL;
3. Blanda väl genom centrifugering och kör på maskin.
Kvalitetskontroll:
1. Funktionstestning: sensitivitet, specificitet, reproducerbarhet av qPCR.
2. Ingen exogen nukleasaktivitet, ingen exogen endo/exonukleaskontamination.
Teknisk information:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG använder ett nytt varmstartsenzym som möjliggör snabb varmstart inom 1~5 minuter;genom speciell buffertformulering är den lämplig för multiplexfluorescerande kvantitativa PCR-reaktioner.
2. Den har högre specificitet vilket avsevärt förbättrar känsligheten för fluorescenskvantitativ PCR-gränsdetektering, vilket gör att amplifieringskurvorna normaliseras, fluorescensvärde erhåller uppenbar förbättring vid mallar med låg koncentration, lämpliga som högkänsliga fluorescenskvantitativa PCR-detektionsreagenser.
3. För primrar med lägre hybridiseringstemperatur eller längre än 200 bp fragment rekommenderas en 3-stegsmetod.
4. Användningseffektiviteten för dUTP och känsligheten för UNG-enzym skiljer sig för olika målgener, så om användning av UNG-system leder till en minskning av detektionskänsligheten, bör reaktionssystemet justeras och optimeras.Kontakta vårt företag om teknisk support krävs.
5. Använd dedikerade områden och pipetter före och efter amplifiering, använd handskar under drift och byt ut dem ofta;Öppna inte reaktionsröret efter PCR-slutförandet för att minimera kontaminering av prover med PCR-produkter.
