Proteinas K mNGS (vätska)
Proteinas K är ett stabilt serinproteas med bred substratspecificitet.Det bryter ned många proteiner i det naturliga tillståndet även i närvaro av rengöringsmedel.Bevis från kristall- och molekylstrukturstudier indikerar att enzymet tillhör subtilisinfamiljen med en aktiv platskatalytisk triad (Asp39-Hans69-Ser224).Det dominerande stället för klyvning är peptidbindningen intill karboxylgruppen av alifatiska och aromatiska aminosyror med blockerade alfa-aminogrupper.Det används ofta för sin breda specificitet.Detta proteinas K är speciellt designat för mNGS.Jämfört med det andra proteinas K innehåller det ännu mindre nukleinsyrakontamination med samma enzymatiska prestanda, vilket bättre skulle kunna säkerställa nedströms mNGS-applikationen.
Förvaringsförhållanden
2-8 ℃ i 2 år
Specifikation
| Utseende | Färglös till ljusbrun vätska |
| Aktivitet | ≥800 U/ml |
| Proteinkoncentration | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Ingen upptäckt |
| DNas | Ingen upptäckt |
| RNase | Ingen upptäckt |
Egenskaper
| EG-nummer | 3.4.21.64(Rekombinant från Tritirachium album) |
| Isoelektrisk punkt | 7,81 |
| Optimalt pH | 7,0- 12,0 Fig. 1 |
| Optimal temperatur | 65 ℃ Fig. 2 |
| pH-stabilitet | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Termisk stabilitet | Under 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig. 4 |
| Lagringsstabilitet | Över 90 % aktivitet i 12 månader vid 25 ℃ |
| Aktivatorer | SDS, urea |
| Inhibitorer | diisopropylfluorfosfat;fenylmetylsulfonylfluorid |
Ansökningar
1. Genetisk diagnostiksats
2. RNA- och DNA-extraktionssatser
3. Extraktion av icke-proteinkomponenter från vävnader, nedbrytning av proteinföroreningar, såsom DNAvacciner och beredning av heparin
4. Framställning av kromosom-DNA genom pulsad elektrofores
5. Western blot
6. Enzymatisk glykosylerad albuminreagens in vitro-diagnos
Försiktighetsåtgärder
Använd skyddshandskar och skyddsglasögon vid användning eller vägning, och håll väl ventilerad efter användning.Denna produkt kan orsaka hudallergisk reaktion och allvarlig ögonirritation.Vid inandning kan det orsaka allergi- eller astmasymtom eller dyspné.Kan orsaka irritation i luftvägarna.
Enhetsdefinition
En enhet (U) definieras som mängden enzym som krävs för att hydrolysera kasein för att producera 1 μmoltyrosin per minut under följande förhållanden.
Beredning av reagens
Reagens I: 1 g mjölkkasein löstes i 50 ml 0,1 M natriumfosfatlösning (pH 8,0), inkuberades i 65-70 ℃ vatten i 15 minuter, omrördes och löstes, kyldes med vatten, justerades med natriumhydroxid till pH 8,0 och fast volym 100 ml.
Reagens II: 0,1 M triklorättiksyra, 0,2 M natriumacetat, 0,3 M ättiksyra.
Reagens III: 0,4 M Na2CO3lösning.
Reagens IV: Forint-reagens utspätt med rent vatten i 5 gånger.
Reagens V: Enzymspädningsmedel: 0,1 M natriumfosfatlösning (pH 8,0).
Reagens VI: tyrosinlösning: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrosin löst med 0,2M HCl.
Procedur
1. 0,5 ml reagens I förvärms till 37 ℃, tillsätt 0,5 ml enzymlösning, blanda väl och inkubera vid37 ℃ i 10 minuter.
2. Tillsätt 1 ml reagens II för att stoppa reaktionen, blanda väl och fortsätt inkubationen i 30 minuter.
3. Centrifugera reaktionslösning.
4. Ta 0,5 ml supernatant, tillsätt 2,5 ml reagens III, 0,5 ml reagens IV, blanda väl och inkubera vid 37 ℃i 30 minuter.
5. OD660bestämdes som OD1;blank kontrollgrupp: 0,5 ml reagens V används för att ersätta enzymlösning för att bestämma OD660som OD2, AOD=OD1-OD2.
6. L-tyrosin standardkurva: 0,5 ml olika koncentrationer av L-tyrosinlösning, 2,5 ml reagens III, 0,5 ml reagens IV i 5 ml centrifugrör, inkubera i 37 ℃ i 30 minuter, detektera för OD660för olika koncentrationer av L-tyrosin, erhöll sedan standardkurvan Y=kX+b, där Y är L-tyrosinkoncentrationen, X är OD600.
Beräkning
2: Total volym reaktionslösning (ml)
0,5: Volym enzymlösning (ml)
0,5: Reaktionsvätskevolym som används vid kromogen bestämning (mL)
10: Reaktionstid (min)
Df: Spädningsmultipel
C: Enzymkoncentration (mg/ml)
Referenser
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2:a upplagan, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Siffror
Fikon.1 Optimalt pH
100 mM buffertlösning: pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, Glycin-NaOH. Enzymkoncentration: 1mg/ml
Fig.2 Optimal temperatur
Reaktion i 20 mM K-fosfatbuffert pH 8,0.Enzymkoncentration: 1 mg/ml
Fig. 3 pH Stabilitet
25 ℃, 16 h-behandling med 50 mM buffertlösning: pH 4,5-5,5, Acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glycin-NaOH.Enzymkoncentration: 1 mg/ml
Fig.4 Termisk stabilitet
30 min behandling med 50 mM Tris-HCl-buffert, pH 8,0.Enzymkoncentration: 1 mg/ml
Fig.5 Förvaring stability at 25℃
