2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Kat.nr: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) är designad för att utföra PCR direkt från prover utan DNA-extraktion eller provberedning.Detta reagens består av varmstartad DNA-polymeras, uracil-DNA-glykosylas (UNG), RNas-hämmare, MgCl2, dNTP (med dUTP istället för dTTP) och stabilisatorer för kvantitativ PCR (qPCR).Detta reagens ger hög inhibitortolerans och kan därför appliceras direkt på detektering av prover som svalgpinne, saliv, antikoagulerat helblod, plasma och serum utan DNA-extraktion.Reagenset använder proprietär buffert för qPCR med blandade enzymer av anti-inhiberande DNA-polymeras och UNG-enzym.Därför kan det erhålla en bra amplifiering av målgener i prover som innehåller inhibitorer och hämma falsk positiv amplifiering orsakad av PCR-rest- och aerosolföroreningar.Detta reagens är kompatibelt med de flesta fluorescerande kvantitativa PCR-instrument, såsom Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche och så vidare.
Komponenter
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Förvaringsförhållanden
Alla komponenter bör förvaras vid -20 ℃ för långtidsförvaring och 4 ℃ i upp till 3 månader.Blanda noggrant efter upptining och centrifugera före användning.Undvik frekvent frysning-upptining.
Cykelprotokoll
| Steg | Temperatur | Tid | Cykel |
| Matsmältning | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Polymerasaktivering | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denaturera | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 |
| Glödgning/förlängning | 56-64 ℃ | 20-60-tal |
Instruktioner för pipettering
| Reagens | Volym per reaktion | Volym per reaktion | Slutlig koncentration |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 µL | 1 µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix1, 2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Prov3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Total volym | 25 μL | 50 μL | - |
1. Den slutliga koncentrationen av primer är vanligtvis 0,2μM.För bättre resultat kan primerkoncentrationen optimeras inom intervallet 0,2-1μM.
2. Generellt kan sondkoncentrationen optimeras inom intervallet 0,1-0,3μM.Den optimala koncentrationen av sonden är relaterad till realtids-PCR-amplifieringsinstrumentet, typen av sond och typen av fluorescerande märkningssubstans.Se instrumentmanualen eller de specifika kraven för varje fluorescerande sond.
3. Olika typer av prover innehåller olika typer och innehåll av inhibitor och kopietal av målgen.Provvolymen bör beaktas utifrån faktiska tillstånd.Gör en utspädning av provet genom att tillsätta nukleasfritt vatten eller TE-buffert, om nödvändigt.
4. Rekommenderad volym av olika prover:
| Prov | Volym för en 50 μL reaktion | Maximal förhållande |
| Antikoagulerat helblod | 2,5 μL | 5% |
| Plasma | 15 μL | 30 % |
| Serum | 10 μL | 20 % |
| Halspinne | 10 μL | 20 % |
| Saliv | 10 μL | 20 % |
Kvalitetskontroll
1. Funktionsdetektion: känslighet, specificitet och repeterbarhet av qPCR.
2. Ingen exogen nukleasaktivitet: ingen exogen endonukleas och exonukleasförorening.
Anteckningar om produkten
1. Denna produkt använder en ny typ av varmstartad DNA-polymeras, som kan aktiveras på 1-5 minuter. Eftersom dess reaktionsbuffert har optimerats är den mer lämpad för dubbel eller multipel fluorescens kvantitativ PCR med hjälp av probemetod.
2. Om Rn-värdet för PCR-amplifieringen är för lågt eller om amplifieringen uppenbarligen hämmas, kan en minskning av provmängden, ökad reaktionsvolym eller tidigare utspädning av provet förbättra resultaten.
3. Insamling av blod, saliv, urin, svalgpinne, etc. bör följa de kliniska kriterierna, och färskt prov kan användas för att förhindra nedbrytning av nukleinsyra.
4. Eftersom olika amplikoner har olika användningseffektivitet än dUTP och känslighet för UNG, bör reagenserna optimeras om detektionskänsligheten minskar när UNG-systemet används.Kontakta oss för teknisk support om det behövs.
5. För att undvika amplifiering av överförda PCR-produkter mellan enstegsreaktioner krävs ett särskilt experimentområde och pipett för amplifiering.Använd handskar och byt ofta och öppna inte reaktionsröret efter PCR-amplifiering.
