Uracil DNA Glycosylas
Uracil-DNA Glycosylas (UNG eller UDG) är en rekombinant klon av E.coli med en molekylvikt på 25 kDa.Det katalyserar frisättningen av fritt uracil från uracil-innehållande enkelsträngat och dubbelsträngat DNA, och är inaktivt mot RNA och kan användas för att förhindra kontaminering av PCR-amplifieringsprodukter.Verkningsprincipen bygger på det faktum att om dUTP ersätts med dTTP i PCR-reaktionen och en PCR-amplifieringsprodukt som innehåller dU-baser bildas, kan enzymet selektivt bryta U-basernas glykosidbindning i enkelsträngade och dubbelsträngade DNA och bryt ned PCR-amplifieringsprodukten.
Rekommenderad applikation
Kontamineringsförebyggande amplifiering
Lagringstillstånd
-20°C för långtidsförvaring, bör blandas väl före användning, undvik frekvent frys-upptining.
Lagringsbuffert
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilisator, 50 % glycerol.
Enhetsdefinition
Mängden enzym som krävs för att bryta ned 1 µg enkelsträngat DNA innehållande dU-baser på 1 timme vid 37°C är 1 enhet.
Kvalitetskontroll
1.SDS-PAGE elektroforetisk renhet större än 98 %
2.Amplifieringskänslighet, batch-till-batch-kontroll, stabilitet
3.Efter att 1 U UNG har behandlats vid 50 ℃ i 2 minuter bör mallen som innehåller U under 103 kopior vara fullständigt nedbruten och ingen amplifieringsprodukt kan produceras
4.Ingen exogen nukleasaktivitet
Instruktioner
| Komponenter | Volym (μL) | Slutlig koncentration |
| 10 × PCR-buffert (dNTP-fri, Mg²+fri) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ersätt dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1–0,5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Mall | - | ＜1μg/reaktion |
| ddH2O | Till 50 | - |
Notera: a: Om den används för qPCR/qRT-PCR, ska den fluorescerande sonden läggas till reaktionssystemet.Vanligtvis kan en slutlig primerkoncentration på 0,2 μM ge bra resultat;när reaktionsprestanda är dålig kan primerkoncentrationen justeras i intervallet 0,2-1 μM.Vanligtvis är sondkoncentrationen optimerad inom intervallet 0,1-0,3 μM.Koncentrationsgradientexperiment kan utföras för att hitta den bästa kombinationen av primer och sond.
Anteckningar
1.UNG-enzym kan användas för att ta bort de kontaminerade dUTP-amplifieringsprodukterna från reaktionssystemet före PCR-amplifieringsreaktionen, för att sedan undvika falskt positiva resultat på grund av produktkontamination.
2.Den optimala temperaturen för UNG-enzym som ska användas i PCR-reaktionen mot kontaminering är i allmänhet 50 ℃ under 2 minuter;inaktiveringsvillkoret är 95 ℃ i 5 minuter.
3.Undvik frekvent frysning och upptining och utsätt inte för stora temperaturfluktuationer.
4.Olika gener som ska amplifieras har olika utnyttjandeeffektivitet av dUTP och känslighet för UNG-enzym, därför, om användningen av UNG-system leder till en minskning av detektionskänsligheten, bör reaktionssystemet justeras och optimeras, om du behöver teknisk support, vänligen kontakta vårt bolag.
