Proteinas K NGS (pulver)
Kat.nr: HC4507A
NGS Protease K är ett stabilt serinproteas med hög enzymaktivitet och bred substratspecificitet. Enzymet bryter företrädesvis ner esterbindningar och peptidbindningar intill C-terminalen av hydrofoba aminosyror, svavelinnehållande aminosyror och aromatiska aminosyror.Så det används ofta för att bryta ned proteiner till korta peptider.NGS Protease K är ett typiskt serinproteas med Asp39-Hans69-Ser224katalytisk triad som är unik för serinproteaser, och det katalytiska centret är omgivet av tow Ca2+bindningsställen för stabilisering, bibehållande av hög enzymaktivitet under ett bredare spektrum av förhållanden.
Specifikation
| Utseende | Vitt till benvitt amorft pulver, lyofiliserat |
| Specifik aktivitet | ≥40 U/mg fast |
| DNas | Ingen upptäckt |
| RNase | Ingen upptäckt |
| Biobörda | ≤50 CFU/g fast ämne |
| Nukleinsyrarest | <5 pg/mg fast |
Egenskaper
| Källa | Tritirachium album |
| EG-nummer | 3.4.21.64(Rekombinant från Tritirachium album) |
| Molekylvikt | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrisk punkt | 7.81 Fig.1 |
| Optimalt pH | 7.0-12.0 (Alla utför hög aktivitet) Fig.2 |
| Optimal temperatur | 65℃ Fig.3 |
| pH-stabilitet | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Termisk stabilitet | Under 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig.5 |
| Lagringsstabilitet | Lagrad vid 25 ℃ i 12 månader Fig.6 |
| Aktivatorer | SDS, urea |
| Inhibitorer | diisopropylfluorfosfat;bensylsulfonylfluorid |
Förvaringsförhållanden
Förvara det lyofiliserade pulvret vid -25~-15 ℃ under lång tid borta från ljus;Efter upplösning, alikvotera i lämplig volym för korttidsförvaring vid 2-8 ℃ borta från ljus eller långtidsförvaring vid -25~-15 ℃ borta från ljus.
Försiktighetsåtgärder
Använd skyddshandskar och skyddsglasögon vid användning eller vägning, och håll väl ventilerad efter användning.Denna produkt kan orsaka hudallergisk reaktion och allvarlig ögonirritation.Vid inandning kan det orsaka allergi- eller astmasymtom eller dyspné.Kan orsaka irritation i luftvägarna.
Enhetsdefinition
En enhet NGS-proteas K definieras som mängden enzym som krävs för att hydrolysera kasein till 1 μmol L-tyrosin under standardbestämningsförhållanden.
Beredning av reagens
| Reagens | Tillverkare | Katalog |
| Kasein tekniskfrån bovin mjölk | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Triklorättiksyra | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natriumacetat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Ättiksyra | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natriumkarbonat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folin-fenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tyrosin | Sigma | 93829 |
Reagens I:
Substrat: 1 % kasein från bovin mjölklösning: lös 1 g bovint mjölkkasein i 50 ml 0,1 M natriumfosfatlösning, pH 8,0, värm i vattenbad vid 65-70 °C i 15 minuter, rör om och lös upp, kyl med vatten, justerat med natriumhydroxid till pH 8,0 och späd till 100 ml.
Reagens II:
TCA-lösning: 0,1 M triklorättiksyra, 0,2 M natriumacetat och 0,3 M ättiksyra (väg 1,64 g triklorättiksyra + 1,64 g natriumacetat + 1,724 ml ättiksyra i tur och ordning, tillsätt 50 ml avjoniserat vatten i tur och ordning, justera med HCl till 4.03 till pH. 100 ml).
Reagens III:
0,4 m natriumkarbonatlösning (väg 4,24 g vattenfritt natriumkarbonat och lös upp i 100 ml vatten)
Reagens IV:
Folinfenolreagens: späd 5 gånger med avjoniserat vatten.
Reagens V:
Enzymspädningsmedel: 0,1 M natriumfosfatlösning, pH 8,0.
Reagens VI:
L-tyrosin standardlösning: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tyrosin löst med 0,2 M HCl.
Procedur
1. Slå på UV-Vis-spektrofotometern och välj fotometrisk mätning.
2. Ställ in våglängden på 660nm.
3. Slå på vattenbadet, ställ in temperaturen på 37℃, se till att temperaturen är oförändrad i 3-5 minuter.
4. Förvärm 0,5 mL substrat i ett 2 mL centrifugrör vid 37 ℃ vattenbad i 10 minuter.
5. Extrahera 0,5 ml utspädd enzymlösning i det förvärmda centrifugröret i 10 minuter.Ställ enzymspädningsmedel som blank grupp.
6. Tillsätt 1,0 mL TCA-reagens omedelbart efter reaktionen.Blanda väl och inkubera i vattenbad i 30 minuter.
7. Centrifugera reaktionslösning.
8. Lägg till följande komponenter i angiven ordning.
| Reagens | Volym |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0,4 M natriumkarbonat | 2,5 ml |
| Folin fenol reagens | 0,5 ml |
9. Blanda väl innan inkubering i vattenbad vid 37 ℃ i 30 minuter.
10. OD660bestämdes som OD1;blank kontrollgrupp: Enzymspädningsmedel används för att ersätta enzymlösning för att bestämma OD660som OD2, AOD=OD1-OD2.
11. L-tyrosin standardkurva: 0,5 mL olika koncentrationer av L-tyrosinlösning, 2,5 mL 0,4 M natriumkarbonat, 0,5 mL Folin-fenolreagens i 5 mL centrifugrör, inkubera i 37 ℃ i 30 minuter, detektera för OD660för olika koncentrationer av L-tyrosin, erhöll sedan standardkurvan Y=kX+b, där Y är L-tyrosinkoncentrationen, X är OD600.
Beräkning
2: Total volym reaktionslösning (ml)
0,5: Volym enzymlösning (ml)
0,5: Reaktionsvätskevolym som används vid kromogen bestämning (mL)
10: Reaktionstid (min)
Df: Spädningsmultipel
C: Enzymkoncentration (mg/ml)
Siffror
Fig. 1 DNA-rest
| Prov | Ave C4 | Nukleinsyra Återställning (pg/mg) | Återhämtning(%) | Total Nucleic Syra ( pg/mg) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83 % | 2,687 |
| PRK+STD2 | 18,723 | 126,728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26,625 | |||
| RNA-fri H2O | Obestämd | — | — | — |
Fig.2 Optimalt pH
Fig.3 Optimal temperatur
Fig.4 pH-stabilitet
Fig.5 Termisk stabilitet
Fig.6 Lagringsstabilitet vid 25℃
