RNAshämmare
Murin RNas-inhibitor är en rekombinant murin RNas-inhibitor uttryckt och renad från E.coli.Det binder till RNas A, B eller C i ett 1:1-förhållande genom icke-kovalent bindning, vilket hämmar aktiviteten hos de tre enzymerna och skyddar RNA från nedbrytning.Det är dock inte effektivt mot RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H eller RNase från Aspergillus.Murin RNas-hämmare testades med RT-PCR, RT-qPCR och IVT mRNA och var kompatibel med olika kommersiella omvända transkriptaser, DNA-polymeraser och RNA-polymeraser.
Jämfört med humana RNas-hämmare innehåller murin RNas-inhibitor inte två cysteiner som är mycket känsliga för oxidation som orsakar inaktivering av inhibitorn.Det gör den stabil vid låga koncentrationer av DTT (mindre än 1 mM).Denna funktion gör den lämplig för användning i reaktioner där höga koncentrationer av DTT är negativa för reaktionen (t.ex. realtids RT-PCR).
Atillämpning
Denna produkt kan användas i stor utsträckning i alla experiment där RNas-interferens är möjlig för att undvika RNA-nedbrytning, såsom:
1.Syntes av den första strängen av cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, etc.
2.Skyddar RNA från nedbrytning under in vitro transkription/translation (t.ex. in vitro virusreplikationssystem).
3.Hämning av RNas-aktivitet under RNA-separation och rening.
Förvaringsförhållanden
Produkten kan förvaras vid -25～- 15 ℃, giltig i 2 år.
Lagringsbuffert
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT och 50 % glycerol.
Enhetsdefinition
Mängden murin RNas-inhibitor som krävdes för att hämma aktiviteten av 5 ng ribonukleas A med 50 % definierades som en enhet (U).
Proteinets molekylvikt
Molekylvikten för murin RNas-inhibitor är 50 kDa.
Kvalitetskontroll
Exonukleas Aktivitet:
40 U murin RNas-hämmare med 1 μg λ -Hind III-digererad DNA vid 37 ℃ under 16 timmar ger ingen nedbrytning, bestämt med agarosgelelektrofores.
Endonukleasaktivitet:
40 U murin RNas-inhibitor med 1 μ g λ DNA vid 37 ℃ under 16 timmar ger ingen nedbrytning, bestämt med agarosgelelektrofores.
Nicking Aktivitet:
40 U murin RNas-inhibitor med 1 μ g pBR322 vid 37 ℃ under 16 timmar ger ingen nedbrytning, bestämt med agarosgelelektrofores.
RNase Aktivitet:
40U murin RNas-inhibitor med 1,6 μ g MS2 RNA under 4 timmar vid 37 ℃ ger ingen nedbrytning, bestämt med agarosgelelektrofores.
E.coli DNA:
40 U murin RNas-hämmare screenas för närvaron av E. coli genomiskt DNA med TaqMan qPCR med primrar specifika för E. coli 16S rRNA-lokus.E. coli genomiska DNA-kontamination är ≤ 0,1 pg/40 U.
Nanmärknings
1. Våldsamma svängningar eller omrörning leder till enzyminaktivering.
2. Det optimala temperaturintervallet för denna inhibitor var 25-55 ℃, och den inaktiverades vid 65 ℃ och uppåt.
3. Aktiviteterna av RNas H, RNas 1 och RNase T1 hämmades inte av murin RNas-inhibitor.
4. Hämningen av RNas-aktivitet hittades inom ett brett pH-område (pH 5-9 var alla aktiva), och den högsta aktiviteten observerades vid pH 7-8.
5. Eftersom ribonukleaser vanligtvis bibehåller aktivitet under denaturerande förhållanden, måste försiktighet iakttas för att undvika denaturerande RNas-inhibitormolekyler som har komplexbildats med ett ribonukleas.För att förhindra frisättning av aktivt ribonukleas bör temperaturer över 50 °C och höga koncentrationer av urea eller andra denaturerande ämnen undvikas.
