Mus Genotyping Kit
Kat.nr: HCR2021A
Denna produkt är ett kit designat för snabb identifiering av musgenotyper, inklusive DNA-råextraktion och PCR-amplifieringssystem.Produkten kan användas för PCR-amplifiering direkt från mussvans, öra, tå och andra vävnader efter enkel klyvning med Lysis Buffer och Proteinase k.Ingen rötning över natten, fenol-kloroformextraktion eller kolonnrening, vilket är enkelt och förkortar den tidskrävande experimenten.Produkten är lämplig för amplifiering av målfragment upp till 2 kb och multiplexa PCR-reaktioner med upp till 3 par primrar.2×Mouse Tissue Direct PCR Mix innehåller genetiskt modifierat DNA-polymeras, Mg2+, dNTPs och ett optimerat buffertsystem för att ge hög amplifieringseffektivitet och inhibitortolerans, så att PCR-reaktioner kan utföras genom att lägga till mall och primers och rehydrera produkten till 1×.PCR-produkten som amplifierats med denna produkt har en framträdande "A"-bas vid 3′-änden och kan användas direkt för TA-kloning efter rening.
Komponenter
| Komponent | Storlek |
| 2×Mus Tissue Direct PCR Mix | 5×1,0 ml |
| Lysisbuffert | 2×20 ml |
| Proteinas K | 800 μL |
Förvaringsförhållanden
Produkter bör förvaras vid -25~-15 ℃ i 2 år.Efter upptining kan Lysis Buffer förvaras vid 2~8 ℃ för kortvarig flergångsanvändning och blanda väl vid användning.
Ansökan
Denna produkt är lämplig för mus knockout-analys, transgen detektion, genotypning och så vidare.
Funktioner
1.Enkel operation: inget behov av att extrahera genomiskt DNA;
2.Bred applikation: lämplig för direkt amplifiering av olika musvävnader.
Instruktioner
1.Frisättning av genomiskt DNA
1) Framställning av lysat
Vävnadslysat bereds enligt antalet musprover som ska lyseras (vävnadslysat bör beredas på plats enligt doseringen och blandas noggrant för användning), och andelen reagens som krävs för ett enstaka prov är som följer:
| Komponenter | Volym (μL) |
| Proteinas K | 4 |
| Lysisbuffert | 200 |
2) Provberedning och lysering
Rekommenderad vävnadsanvändning
| SortsVävnad | Rekommenderad volym |
| Mussvans | 1-3 mm |
| Mus öra | 2-5 mm |
| Mus tå | 1-2 stycken |
Ta en lämplig mängd musvävnadsprover i rena centrifugrör, tillsätt 200μL färskt vävnadslysat till varje centrifugrör, vortexa och skaka, inkubera sedan vid 55 ℃ i 30 minuter och värm sedan vid 98 ℃ i 3 minuter.
3) Centrifugering
Skaka lysatet väl och centrifugera vid 12 000 rpm i 5 minuter.Supernatanten kan användas som mall för PCR-amplifiering.Om mallen behövs för lagring, överför supernatanten till ett annat sterilt centrifugrör och förvara vid -20 ℃ i 2 veckor.
2.PCR-förstärkning
Ta bort 2×Mouse Tissue Direct PCR-blandningen från -20 ℃ och tina på is, blanda upp och ner och förbered PCR-reaktionssystemet enligt följande tabell (operera på is):
| Komponenter | 25μLSystemet | 50μLSystemet | Slutlig koncentration |
| 2×Mus Tissue Direct PCR Mix | 12,5 μL | 25 μL | 1× |
| Primer 1 (10 μM) | 1,0 μL | 2,0 μL | 0,4 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 1,0 μL | 2,0 μL | 0,4 μM |
| Klyvningsprodukta | Som kräver | Som kräver |
|
| ddH2O | Upp till 25μL | Upp till 50μL |
|
Notera:
a) Mängden som tillsätts bör inte överstiga 1/10 av systemet, och om för mycket tillsätts kan PCR-amplifiering hämmas.
Rekommenderade PCR-förhållanden
| Cykelsteg | Temp. | Tid | Cyklar |
| Initial denaturering | 94℃ | 5 min | 1 |
| Denaturering | 94℃ | 30 sek | 35-40 |
| Glödgninga | Tm+3~5℃ | 30 sek | |
| Förlängning | 72℃ | 30 sek/kb | |
| Slutlig förlängning | 72℃ | 5 min | 1 |
| - | 4℃ | Håll | - |
Notera:
a) Glödgningstemperatur: Med hänvisning till primerns Tm-värde, rekommenderas det att ställa in glödgningstemperaturen till det lägre Tm-värdet för primern +3~5℃.
Vanliga problem och lösningar
1.Inga riktade remsor
1) Överdriven lysprodukt.Välj den lämpligaste mängden mall, vanligtvis inte mer än 1/10 av systemet;
2) För stor provstorlek.Späd lysatet 10 gånger och amplifiera sedan, eller minska provstorleken och återlys;
3) Vävnadsprover är inte färska.Det rekommenderas att använda färska vävnadsprover;
4) Dålig primerkvalitet.Använd genomiskt DNA för amplifiering för att verifiera primerkvaliteten och optimera primerdesignen.
2.Icke-specifik amplifiering
1) Glödgningstemperaturen är för låg och cykelnumret är för högt.Öka glödgningstemperaturen och minska antalet cykler;
2) Mallkoncentrationen är för hög.Minska mängden mall eller späd mallen 10 gånger efter amplifiering;
3) Dålig primerspecificitet.Optimera primerdesignen.
Anteckningar
1.För att undvika korskontaminering mellan prover bör flera provtagningsverktyg förberedas och verktygens yta kan rengöras med 2 % natriumhypokloritlösning eller nukleinsyrarengöringsmedel efter varje provtagning om upprepad användning krävs.
2.Det rekommenderas att använda färska musvävnader, och provtagningsvolymen bör inte vara för stor för att undvika att påverka amplifieringsresultaten.
3.Lysisbufferten bör undvika frekvent frysning-upptining och kan förvaras vid 2~8 ℃ för kortvarig flergångsanvändning.Om den förvaras vid låg temperatur kan utfällning förekomma och måste vara helt upplöst före användning.
4.PCR Mix bör undvika frekvent frysning-upptining, och kan förvaras vid 4 ℃ för kortvarig upprepad användning.
5.Denna produkt är endast avsedd för vetenskaplig experimentell forskning och bör inte användas i klinisk diagnos eller behandling.
