M-MLV omvänt transkriptas
RevScript Omvänt transkriptas erhålls genom genteknik.Den har högre cDNA-syntesförmåga, termisk stabilitet och reaktionstemperaturgräns (upp till 60°C).Den syntetiserade cDNA-produkten är upp till 10 kb.Den förstärker mallarnas affinitet och är lämplig för omvänd transkription av RNA-mallar med komplex sekundär struktur eller gener med låg kopia.
Komponenter
| Komponent | HC2003B (10 000 U) | HC2003B (5*10 000 U) | HC2003B (200 000 U) |
| RevScript omvänt transkriptas (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript-buffert | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Lagringstillstånd
Denna produkt bör förvaras vid -25°C~-15°C i 2 år.
Enhetsdefinition
En enhet inkorporerar 1 nmol dTTP i syraolösligt material på 10 minuter vid 37°C med Oligo(dT) som primers.
Reaktionsinställningar
1.Denaturering av RNA-mall (Detta steg är valfritt, denaturering av RNA-mall hjälper till att öppna de sekundära strukturerna, vilket kommer att förbättra utbytet av den första strängens cDNA.)
| Komponenter | Volym (μL) |
| RNase-fri ddH2O | Till 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) eller Random Primer (50 μmol/L) Eller genspecifika primers (2 μmol/L) | 1 |
| eller 1 | |
| eller 1 | |
| RNA-mall | X a |
Anmärkningar:
1) a: Totalt RNA: 1-5 ug eller mRNA: 1-500 ng
2) Inkubera vid 65°C i 5 minuter och överför sedan omedelbart till is för att kyla i 2 minuter.Kort centrifugering för att samla upp reaktionsvätskan, tillsätt reaktionslösningen för omvänd transkription som visas i följande tabell.Pipettera försiktigt för att blanda.
1.Beredning av reaktionsblandningen (20 μL volym)
| Komponenter | Volym (μL) |
| Blandning av föregående steg | 13 |
| 5×buffert | 4 |
| dNTP-blandning (10nmol/L) | 1 |
| Omvänt transkriptas (200 U/μL) | 1 |
| RNashämmare (40 U/μL) | 1 |
1.Utför reaktionen under följande förhållanden:
| Temperatur (°C) | Tid |
| 25°Ca | 5 min |
| 42 °Cb | 15-30 min |
| 85°Cc | 5 min |
Anmärkningar:
1) a.Inkubering vid 25°C i 5 minuter krävs endast för att använda de slumpmässiga hexamererna.Hoppa över det här steget när du använder Oligo (dT)18eller genspecifik primer.
2) b.Den rekommenderade temperaturen för omvänd transkription är 42°C. För mallar med komplicerade sekundära strukturer eller högt GC-innehåll rekommenderas att höja reaktionstemperaturen till 50-55°C.
3) c.Upphettning vid 85°C i 5 minuter för att inaktivera omvänt transkriptas.
4) Produkten kan användas direkt i PCR- eller qPCR-reaktioner, eller förvaras vid -20°C för korttidsförvaring.Det rekommenderas att dela upp produkterna och förvara dem vid -80°C för långtidsförvaring.Undvik frekvent frysning-upptining.
5) Produkten är lämplig för ettstegs RT-qPCR, det rekommenderas att lägga till 10-20 U omvänt transkriptas för varje 25μL reaktionssystem, eller gradvis öka mängden omvänt transkriptas enligt den faktiska situationen.
Anteckningar
1.Vänligen håll experimentområdet rent;Rena handskar och masker bör bäras under drift.Alla förbrukningsvaror som används i experimentet bör vara RNase-fria för att förhindra RNas-kontamination.
2.Alla procedurer bör utföras på is för att förhindra RNA-nedbrytning.
3.RNA-prover av hög kvalitet rekommenderas för att säkerställa hög effektivitet av omvänd transkription.
4.Denna produkt är endast avsedd för forskning.
5.Använd labbrockar och engångshandskar för din säkerhet.
