EndoFree Plasmid Maxi Kit

Lagringsförhållanden

RNaseA bör förvaras vid -30 ~ -15 ℃ och transporteras vid ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger kan lagras vid 2 ~ 8 ℃ i en månad, lagras vid -30 ~ -15 ℃ för långtidsförvaringoch transporteras vid ≤0℃.

Övriga komponenter bör förvaras i rumstemperatur (15 ~ 25 ℃) och transporteras i rumstemperatur.

Komponenter

RNaseA:10 mg/ml, används för att avlägsna RNA.

Buffert P1:bakteriesuspensionsbuffert, tillsätt RNaseA till buffert P1 före första användningen.

Buffert P2:bakteriell lysbuffert (innehållande SDS/NaOH).

Buffert P4:neutraliserande buffert.

Endotoxinrensare:effektivt avlägsna endotoxin från det råa plasmidextraktet.

Buffert PW:tvättbuffert, tillsätt den föreskrivna volymen etanol före första användningen.

Buffert TB:elueringsbuffert.

FastPure DNA Maxi Kolumner:plasmid-DNA-adsorptionskolonner.

Uppsamlingsrör 50 ml:filtratuppsamlingsrör.

Endotoxinfritt uppsamlingsrör:plasmid-DNA-uppsamlingsrör.

Förberedda material

Absolut etanol, isopropanol, 50 ml rundbottnade centrifugrör och 50 ml endotoxinfriacentrifugrör.

Ansökningar

Denna produkt är lämplig för storskalig extraktion av plasmider från 150 - 300 ml bakterielösningodlas över natten.

Experimentprocess

1. Ta 150 – 200 ml (högst 300 ml) bakterielösning odlad över natten och centrifugera kl.ca 11 000 rpm (12 000 × g) i 1 – 2 min.Kassera supernatanten och samla upp bakterier.

Δ När man samlar upp mer än 50 ml bakterielösning kan bakterierna samlas upp genom att tillsätta bakterielösning, centrifugering, kassera supernatanten och andra steg i samma 50 ml-rör för

flera gånger.

2. Tillsätt 7,5 ml buffert P1 (kontrollera om RNaseA har tillsatts buffert P1) till centrifugenrör som innehåller bakterier och blanda noggrant genom att vortexa eller pipettera.

Δ Den fullständiga återsuspensionen av bakterier i detta steg är avgörande för att ge, och det bör inte finnas några bakterieklumpar efter återsuspension.Om det finns bakterieklumpar som inte är ordentligt blandade kommer det att påverka lyset, vilket resulterar i lågt utbyte och renhet.Om OD600 för bakterielösning är 0,65, rekommenderas att 7,5 ml buffert P1 används när man extraherar från 150 ml bakterielösning;när OD600 är 0,75 ska 8 ml buffert P1 användas och volymerna av buffertarna P2 och P4 bör ändras i enlighet med detta.Om volymen av bakterielösningen ökas till 200 ml, rekommenderas attvolymen av buffertarna P1, P2 och P4 ökas proportionellt.

3. Tillsätt 7,5 ml buffert P2 till bakteriesuspensionen från steg 2 och blanda försiktigt upp och ner i 6–8gånger och inkubera i rumstemperatur i 4 – 5 min.

Δ Vänd försiktigt upp och ned för att blanda ordentligt.Vortexning kommer att orsaka den genomiska DNA-fragmenteringen, vilket resulterar i genomiska DNA-fragment i den extraherade plasmiden.Vid denna tidpunkt blir lösningen trögflytande och genomskinlig, vilket visar att bakterierna har lyserats helt.Varaktigheten bör inte överstiga 5 minuter för att undvika förstörelse av plasmiderna.Om lösningen inte är klar kan det bli för många bakterier som resulterar iofullständig lysering, så mängden bakterier bör reduceras på lämpligt sätt.

4. Tillsätt 7,5 ml buffert P4 till bakteriesuspensionen från steg 3 och vänd omedelbart försiktigt 6 – 8 gånger så att lösningen helt neutraliserar buffert P2.Vid denna tidpunkt bör vit flockig fällning uppstå.Centrifugera vid mer än cirka 11 000 rpm (12 000 × g) i 10 – 15 minuter, pipettera försiktigt supernatanten i ett nytt 50 ml rundbottnat centrifugrör (självförberedd) och undvikaspirera den flytande vita fällningen.

Δ Tillsätt buffert P4 och vänd omedelbart för att blanda väl.Låt röret stå tills den vita fällningen fördelas jämnt i lösningen för att förhindra produktion av lokal fällning som kan påverka neutraliseringen.Om det inte finns någon enhetlig vit flockig fällning före centrifugering och supernatanten inte är klar efter centrifugering, kan röretcentrifugeras i ytterligare 5 min.

5. Tillsätt 0,1 gånger volymen (10 % av supernatantvolymen, cirka 2,2 ml) Endotoxin Scavenger till supernatanten från steg 4 och vänd upp och ned för att blanda.Placera lösningen i ett isbad eller sätt in i krossad is (eller kyl och frys) i 5 minuter tills lösningen ändras från grumlig till klar och transparent (eller fortfarandelätt grumlig), och blanda då och då flera gånger.

Δ Efter att Endotoxin Scavenger tillsatts till supernatanten kommer supernatanten att bli grumlig mensupernatanten bör bli klar (eller något grumlig) efter kylning i isbadet.

6. Efter att supernatanten har placerats i rumstemperatur (>25 ℃) i 10 – 15 minuter kommer den att bli grumlig eftersomdess temperatur ökar till rumstemperatur.Sedan ska supernatanten vändas upp och ned för att blandas.

Δ Om rumstemperaturen är lägre eller om du vill minska extraktionstiden kan supernatanten inkuberas i ett 37 ~ 42 ℃ vattenbad i 5 – 10 minuter och nästa steg kan utföras efter supernatantenblir grumlig.

7. Centrifugera supernatanten vid cirka 11 000 rpm (12 000 × g) i 10 minuter vid rumstemperatur (temperaturen måste vara >25 ℃) för att separera fasen.Den övre vattenfasen innehåller DNA medan det nedre blå oljefasskiktet innehåller endotoxin och andra föroreningar.ÖverförDNA-innehållande vattenfas till ett nytt rör ochkassera det oljiga lagret.

Δ Temperaturen under centrifugering måste vara över 25 ℃ eftersom effektiv fasseparation inte gör detinträffa om temperaturen är för låg.

Δ Om fasseparationen inte är effektiv kan centrifugeringstemperaturen justeras till 30 ℃ ochcentrifugeringstiden kan ökas till 15 min.

Δ Sug inte det blå oljiga lagret eftersom det innehåller endotoxin och andra föroreningar.

Mekanism

Återsuspension Lysis Neutralisation

◇ Tillsätt 7,5 ml buffert P1

◇ Tillsätt 7,5 ml buffert P2

◇ Tillsätt 7,5 ml buffert P4

Avlägsnande av endotoxin

◇ Tillsätt 0,1 gånger supernatantvolymen Endotoxin Scavenger

Bindning och tvätt

◇ Tillsätt 0,5 gånger volymen isopropanol

◇ Tillsätt 10 ml buffert PW