5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Kat.nr: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) är en mycket stabil en-rörs sond-baserad blandning lämplig för ettstegs omvänd transkription och kvantitativ PCR (qRT-PCR).Den stöder förblandning av primers och prober och håller sig stabil efter lång tids lagring vid låg temperatur.Provet som ska testas kan tillsättas direkt vid användning, utan ytterligare röröppning/pipetteringsoperation.Denna produkt tillhandahåller komponenter, t.ex. varmstartad DNA-polymeras, M-MLV, värmelabilt uracil-DNA-glykosylas (TS-UNG), RNas-hämmare, MgCl2, dNTP (med dUTP istället för dTTP) och stabilisatorer.Med den genetiskt modifierade snabba amplifieringen omvänt transkriptas och DNA-polymeras är det möjligt att slutföra PCR-amplifieringen inom 20-40 minuter.Detta reagens använder speciell buffert för qPCR med blandade enzymer av anti-inhiberande amplifieringsenzym och UNG-enzym.Därför kan det erhålla bra amplifiering av målgener och förhindra falsk amplifiering orsakad av PCR-rest- och aerosolföroreningar.Detta reagens är kompatibelt med de flesta fluorescenskvantitativa PCR-instrument från tillverkare som Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad och Roche.
Komponent
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Förvaringsförhållanden
Alla komponenter bör förvaras vid -20 ℃ för långtidsförvaring och 4 ℃ i upp till 3 månader.Blanda noggrant efter upptining och centrifugera före användning.Undvik frekvent frysning-upptining.
Förberedelse av qRT-PCR-reaktionssystem
| Komponenter | 25μLSystemet | 50μLSystemet | Slutlig koncentration |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 μL | 2 μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1 μL | 2 μL | 1× |
| Mall RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Upp till 25μL | Upp till 50μL | – |
1) a. Den slutliga koncentrationen av primer är vanligtvis 0,2μM.För bättre resultat kan primerkoncentrationen optimeras inom intervallet 0,2-1μM.Generellt kan sondkoncentrationen optimeras inom intervallet 0,1-0,3μM.
2) b. Vid användning av en snabb PCR-procedur kan ökning av koncentrationen av primrar och prober resultera i bättre amplifieringsresultat, och deras förhållande bör optimeras därefter.
3) Olika typer av prover innehåller olika typer och innehåll av inhibitor och kopietal av målgen.Provvolymen bör beaktas utifrån faktiska tillstånd.Späd ut provet med nukleasfritt vatten eller TE-buffert, om nödvändigt.
Reaktion Cförhållanden
| Vanlig PCR-procedur | Snabb PCR-procedur | ||||||
| Procedur | Temp. | Tid | Cykel | Procedur | Temp. | Tid | Cykel |
| Omvänd transkription | 50 ℃ | 10-20 minuter | 1 | Omvänd transkription | 50 ℃ | 5 min | 1 |
| Polymeras Aktivering | 95 ℃ | 1-5 min | 1 | Polymeras Aktivering | 95 ℃ | 30-talet | 1 |
| Denaturering | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 | Denaturering | 95 ℃ | 1-3 s | 40-50 |
| Glödgning och Förlängning | 56-64 ℃ | 20-60-tal | Glödgning och Förlängning | 56-64 ℃ | 3-20 s | ||
Kvalitetskontroll
1.Funktionsdetektion: sensitivitet, specificitet och repeterbarhet av qPCR.
2.Ingen exogen nukleasaktivitet: ingen exogen endonukleas och exonukleasförorening.
Anteckningar
1.Amplifieringshastigheten för snabbt DNA-polymeras är inte mindre än 1 kb/10s.Olika PCR-instrument har olika uppvärmnings- och kylningshastigheter, temperaturkontrolllägen och värmeledningsförmåga, och därför är optimering av din primer/sondkoncentration och körmetod i kombination med ditt specifika snabba PCR-instrument väsentligt.
2.Denna produkt har bred tillämpbarhet och är lämplig för högkänslig molekylär diagnos.Trestegs PCR-metod rekommenderas för primrar med låg hybridiseringstemperatur eller för amplifiering av långa fragment över 200 bp.
3.Eftersom olika amplikoner har olika utnyttjandeeffektivitet av dUTP och olika känslighet för UNG, bör reagenserna optimeras om detektionskänsligheten minskar vid användning av UNG-system.Kontakta oss för teknisk support om det behövs.
4.För att undvika amplifiering av överförda PCR-produkter krävs ett särskilt experimentområde och pipett för amplifiering.Använd handskar och byt ofta och öppna inte PCR-röret efter amplifiering.
