Temperaturkänslig UNG
Temperaturkänslig UNG (TS-UNG) är en erhållen genom rekombinant expression i E. coli.Enzymet katalyserar frisättningen av fritt uracil från uracil-innehållande enkel- och dubbelsträngat DNA och är inaktivt mot RNA.Jämfört med det konventionella UNG-enzymet av E. coli-genursprung har TS-UNG-enzymet högre aktivitet vid låga temperaturer (20℃~37℃) och är temperaturkänsligt och lätt inaktiverat (50℃), vilket undviker nedbrytningen av dUTP-innehållande amplifiering produkter vid rumstemperatur genom den restaktivitet som kan finnas kvar efter inaktivering av det konventionella UNG-enzymet.Därför är TS-UNG-enzym inte bara lämpligt för PCR-kontaminationsförebyggande reaktioner, utan matchar också väl med RT-PCR-amplifieringsprogrammet och kan användas i RT-PCR-kontaminationsförebyggande reaktioner.
Rekommenderad applikation
Kontamineringsförebyggande amplifiering
Lagringstillstånd
-20°C för långtidsförvaring, bör blandas väl före användning, undvik frekvent frys-upptining.
Lagringsbuffert
20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilisator, 50 % glycerol.
Enhetsdefinition
Mängden enzym som krävs för att bryta ned 1 µg enkelsträngat DNA innehållande dU-baser på 1 timme vid 37°C är 1 enhet aktivitet (U).
Kvalitetskontroll
1.SDS-PAGE elektroforetisk renhet större än 98 %
2.Nedbrytningsaktivitet, batch-till-batch-kontroll, stabilitet
3.Ingen exogen nukleasaktivitet, ingen exogen endonukleas eller exonukleaskontamination.
Instruktioner
| Komponenter | Volym (μL) | Slutlig koncentration |
| 10 × PCR-buffert (dNTP-fri, Mg²+fri) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ersätt dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 1 U/μLTS-UNG | 0,5 (0,1-0,5) | 0,5 U (0,1–0,5 U) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Mall | - | ＜1μg/reaktion |
| ddH2O | Till 50 | - |
Obs: a: Om den används för qPCR/qRT-PCR, bör den fluorescerande sonden läggas till reaktionssystemet.Vanligtvis kan en slutlig primerkoncentration på 0,2 μM ge bra resultat;när reaktionsprestanda är dålig kan primerkoncentrationen justeras i intervallet 0,2-1 μM.Vanligtvis är sondkoncentrationen optimerad inom intervallet 0,1-0,3 μM.Koncentrationsgradientexperiment kan utföras för att hitta den bästa kombinationen av primer och sond.
Anteckningar
1.Den optimala reaktionstemperaturen för TS-UNG-enzymet är relativt låg, och den kan optimeras i intervallet 20℃~37℃, doseringen av enzym och reaktionstiden kan optimeras i intervallet 0,1~0,5 U, 5~ 10 minuter;och enzymet kan inaktiveras i processen med omvänd transkription.
2.Den är lämplig för PCR och RT-PCR för att förhindra kontaminering.
3.Undvik frekvent frysning och upptining och utsätt inte för stora temperaturfluktuationer.
4.Olika gener som ska amplifieras har olika utnyttjandeeffektivitet av dUTP och känslighet för UNG-enzym, därför, om användningen av UNG-system leder till en minskning av detektionskänsligheten, bör reaktionssystemet justeras och optimeras, om du behöver teknisk support, vänligen kontakta vårt bolag.
