PNGase F
Peptid-N-glykosidas F(PNGase F) är den mest effektiva enzymatiska metoden för att ta bort nästan alla N-länkade oligosackarider från glykoproteiner.PNGase F är ett amidas, som klyver mellan de inre mest GlcNAc- och asparaginresterna av högmannos-, hybrid- och komplexa oligosackarider från N-länkade glykoproteiner.
Ansökan
Detta enzym är användbart för att ta bort kolhydratrester från proteiner.
Förberedelse och specifikation
| Utseende | Färglös vätska |
| Proteinrenhet | ≥95 % (från SDS-PAGE) |
| Aktivitet | ≥500 000 U/ml |
| Exoglykosidas | Ingen aktivitet kunde detekteras (ND) |
| Endoglykosidas F1 | ND |
| Endoglykosidas F2 | ND |
| Endoglykosidas F3 | ND |
| Endoglykosidas H | ND |
| Proteas | ND |
Egenskaper
| EG-nummer | 3.5.1.52(Rekombinant från mikroorganism) |
| Molekylvikt | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrisk punkt | 8. 14 |
| Optimalt pH | 7,0-8,0 |
| Optimal temperatur | 65°C |
| Substratspecificitet | Klyvning av glykosidbindningar mellan GlcNAc och asparaginrester Fig. 1 |
| Erkännande webbplatser | N-länkade glykaner om de inte innehåller α1-3 fukos Fig. 2 |
| Aktivatorer | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Förvaringstemperatur | -25 ~-15 ℃ |
| Värmeinaktivering | En 20 µL reaktionsblandning innehållande 1 µL PNGase F inaktiveras genom inkubation vid 75 °C i 10 minuter. |
Fig. 1 Substratspecificitet för PNGase F
Fig. 2 Igenkänning av PNGase F.
När de interna GlcNAc-resterna är kopplade till al-3-fukos kan PNGas F inte klyva N-kopplade oligosackarider från glykoproteiner.Denna modifiering är vanlig i växter och vissa insektsglykoproteiner.
Componenter
|
| Komponenter | Koncentration |
| 1 | PNGase F | 50 ul |
| 2 | 10×Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 ul |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 ul |
| 4 | 10 % NP-40 | 1000 ul |
Enhetsdefinition
En enhet (U) definieras som mängden enzym som krävs för att avlägsna >95 % av kolhydraten från 10 µg denaturerat RNas B på 1 timme vid 37°C i en total reaktionsvolym på 10 µL.
Reaktionsförhållanden
1. Lös upp 1-20 µg glykoprotein med avjoniserat vatten, tillsätt 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer och H2O (om nödvändigt) för att skapa en total reaktionsvolym på 10 µl.
2.Inkubera vid 100°C i 10 minuter, kyl det på is.
3.Tillsätt 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10 % NP-40 och blanda.
4.Tillsätt 1-2 µl PNGase F och H2O (om nödvändigt) för att göra en total reaktionsvolym på 20 µl och blanda.
5.Inkubera reaktionen vid 37°C i 60 min.
6.För SDS-PAGE-analys eller HPLC-analys.
