mRNA Cap2'-O-Methyltransferas

mRNA Cap 2'-O-metyltransferas härleddes från en rekombinant E. coli-stam som bär genen för vaccinia mRNA Cap 2'-O-Methyltransferas.Detta enzym lägger till en metylgrupp vid 2´-O-positionen av den första nukleotiden intill capstrukturen vid 5´änden av RNA:t. Enzymet använder S-adenosylmetionin (SAM) som en metyldonator för att metylera capped RNA (cap). -0) vilket resulterar i en cap-1-struktur.

Cap1-strukturen kan öka translationseffektiviteten, vilket förbättrar uttrycket av mRNA i transfektions- och mikroinjektionsexperiment. Detta enzym kräver specifikt RNA med ett m7GpppN-lock som substrat.Den kan inte använda RNA med pN, ppN, pppN eller GpppN i 5´-änden.Capped RNA kan framställas via in vitro-transkription med användning av cap-analog eller genom enzymatisk kapning med användning av Vaccinia Capping Enzyme.

Komponenter

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferas (50U/μL)

10×Capping-reaktionsbuffert

Lagring

-25 ～- 15 ℃ för förvaring （ Undvik upprepade frys-upptiningscykler）

Lagringsbuffert

20 mM Tris-HCl (pH 8,0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glycerol.

Enhetsdefinition

En enhet definieras som mängden enzym som krävs för att metylera 10 pmol av 80 nt capped RNA-transkript på 1 timme vid 37°C.

Kvalitetskontrollanalyser

Exonukleas:50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferas med 1μg λ-Hind III-digererad DNA vid 37 ℃ under 16 timmar ger ingen nedbrytning, bestämt med agarosgelelektrofores.

Endonukleas: 50 U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferas med 1 μg λDNA vid 37 ℃ under 16 timmar ger ingen nedbrytning, bestämt med agarosgelelektrofores.

Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferas med 1μg pBR322 vid 37 ℃ under 16 timmar ger ingen nedbrytning, bestämt med agarosgelelektrofores.

RNase: 50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferas med 1,6 μg MS2 RNA under 4 timmar vid 37 ℃ ger ingen nedbrytning, bestämt med agarosgelelektrofores.

E. coli DNA: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferas screenas för närvaro avE. coli genomiskt DNA med TaqMan qPCR med primers specifika förE. coli 16S rRNA-lokus.DeE. coli genomisk DNA-kontamination är =1E. coli genomet.

Bakteriell Endotoxin: LAL-test, enligt Chinese Pharmacopoeia IV 2020-utgåvan, gelgränstestmetod, allmän regel (1143).Bakteriell endotoxinhalt bör vara =10 EU/mg.

Reaktionssystem och förhållanden

1. Kombinera en lämplig mängd Capped RNA och RNase-fri H2O i ett 1,5 ml mikrofugrör till en slutlig volym på 16,0 µL.

2. Värm vid 65 ℃ i 5 minuter följt av ett isbad i 5 minuter.

3. Lägg till följande komponenter i angiven ordning (för metylering av Capped RNA

mindre än 10

*10× Capping Reaction Buffert: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkubera vid 37 ℃ i 1 timme (2 timmars inkubation rekommenderas för målfragmentet mindre än 200 nt).

Ansökningar

För att förbättra mRNA-uttryck under mikroinjektion och transfektionsexperiment.

Anmärkningar om användning

1. Före reaktion ska RNA renas och lösas i nukleasfritt vatten, alla lösningar bör inte innehålla några EDTA och joner.

2. Det rekommenderas att värma prov-RNA:t vid 65 ℃ i 5 minuter före reaktionen för att ta bort den sekundära strukturen på 5'-änden av transkriptet.Den kan förlängas till 10 min för komplex 5'-terminal struktur.