M-MLV Neoscript omvänt transkriptas
Neoscript Reverse Transcriptase är ett omvänt transkriptas som erhålls genom mutationsscreening av M-MLV-genen från Moloney murint leukemivirus ursprung och uttryck i E.coli.Enzymet tar bort RNase H-aktivitet, har högre temperaturtolerans och är lämpligt för omvänd transkription vid hög temperatur.Därför är det användbart för att eliminera de ogynnsamma effekterna av RNA-högnivåstrukturen och icke-specifika faktorer på cDNA-syntes, och har högre stabilitet och förmåga till omvänd transkriptionssyntes.Enzymet har högre stabilitet och förmåga till omvänd transkriptionssyntes.
Komponenter
1.200 U/μL Neoscript omvänt transkriptas
2.5 × First-Strand-buffert (valfritt)
* 5 × First-Strand Buffer innehåller inte dNTP, lägg till dNTP när du förbereder reaktionssystemet
Rekommenderad applikation
1.Ettstegs QRT-PCR.
2.RNA-virus upptäckt.
Lagringstillstånd
-20°C för långtidsförvaring, bör blandas väl före användning, undvik frekvent frys-upptining.
Enhetsdefinition
En enhet innehåller 1 nmol dTTP på 10 minuter vid 37°C med användning av poly(A)•oligo(dT)25som mall/primer.
Kvalitetskontroll
1.SDS-PAGE elektroforetisk renhet större än 98%.
2.Amplifieringskänslighet, batch-till-batch-kontroll, stabilitet.
3.Ingen exogen nukleasaktivitet, ingen exogen endonukleas eller exonukleaskontamination
Reaktionsinställningar för första kedjereaktionslösning
1.Framställning av reaktionsblandningen
| Komponenter | Volym |
| Oligo(dT)12-18 Primer eller Random Primera Eller genspecifika primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Mall RNA | Totalt RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNas-fri dH2O | Till 10 μL |
Anmärkningar:a/b: Välj olika typer av primers enligt dina experimentella behov.
2.Värm vid 65°C i 5 minuter och kyl snabbt på is i 2 minuter.
3.Tillsätt följande komponenter till ovanstående system till en total volym av 20µL och blanda försiktigt:
| Komponenter | Volym (μL) |
| 5 × First-Strand-buffert | 4 |
| Neoscript omvänt transkriptas (200 U/μL) | 1 |
| RNashämmare (40 U/μL) | 1 |
| RNas-fri dH2O | Till 20 μL |
4. Utför reaktionen enligt följande villkor:
(1) Om Random Primer används, bör reaktionen utföras vid 25 ℃ i 10 minuter och sedan vid 50 ℃ i 30 ~ 60 minuter;
(2) Om Oligo dT eller specifika primers används, bör reaktionen utföras vid 50 ℃ i 30~60 minuter.
5.Värm vid 95 ℃ i 5 minuter för att inaktivera Neoscript Reverse Transcriptase och avsluta reaktionen.
6.Omvänd transkriptionsprodukter kan användas direkt i PCR-reaktion och fluorescenskvantitativ PCR-reaktion, eller lagras vid -20 ℃ under lång tid.
PCR Reaction:
1.Framställning av reaktionsblandningen
| Komponenter | Koncentration |
| 10 × PCR-buffert (dNTP-fri, Mg²+ fri) | 1× |
| dNTP (10 mM varje dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA-polymeras (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Malla | ≤10 % First Chain Reaction Solution (2 μL) |
| ddH2O | Till 50 μL |
Anmärkningar:a: Om för mycket första kedjereaktionslösning tillsätts kan PCR-reaktionen hämmas.
2.PCR-reaktionsförfarande
| Steg | Temperatur | Tid | Cyklar |
| Fördenaturering | 95 ℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturering | 95 ℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Glödgning | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Förlängning | 72℃ | 10-60 sek |
Anteckningar
1.Lämplig för omvänd transkriptionstemperaturoptimering inom området 42℃~55℃.
2.Den har bättre stabilitet, är lämplig för omvänd transkriptionsamplifiering vid hög temperatur.Dessutom är det gynnsamt för att effektivt passera genom komplexa strukturella regioner av RNA.Det ocksåär lämplig för enstegs multiplex fluorescens kvantitativ RT-PCR-detektion.
3.God kompatibilitet med olika PCR-amplifieringsenzymer och är lämplig för högkänsliga RT-PCR-reaktioner.
4.Lämplig för kvantitativ RT-PCR-reaktion med hög känslighet i ett stegsfluorescens, förbättrar effektivt detekteringshastigheten för låg koncentration av mallar.
5.Lämplig för cDNA-bibliotekskonstruktion.
