Dubbelsträngat RNA (dsRNA) ELISA KIT

Detta kit är en Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) koppling med biotin-Streptavidin-systemet, för kvantitativ mätning av dsRNA med längd över 60 baspar (bp), oavsett sekvens.Plattan har förbelagts med anti-dsRNA-antikropp.dsRNA som finns i provet tillsätts och binder till antikroppar belagda på brunnarna.Och sedan tillsätts biotinylerad anti-dsRNA-antikropp och binder till dsRNA i provet.Efter tvätt tillsätts HRP-Streptavidin och binder till den biotinylerade anti-dsRNA-antikroppen.Efter inkubation tvättas obundet HRP-Streptavidin bort.Sedan tillsätts TMB-substratlösning och katalyseras av HRP för att producera en blå färgprodukt som ändrades till gul efter tillsats av sur stopplösning.Densiteten av gult är proportionell mot målmängden av dsRNA som fångas i plattan.Absorbansen mäts vid 450 nm.

Ansökan

Detta kit är för kvantitativ mätning av kvarvarande dsRNA.

Kitkomponenter

Lagring och stabilitet

1. För oanvänd kit: Hela kitet kan förvaras vid 2~8℃ i hållbarhetstid.Starkt ljus bör undvikas för lagringsstabilitet.

2. För begagnat kit: När mikroplattan har öppnats, täck oanvända brunnar med plattförseglare och återgå till foliepåsen som innehåller torkmedelsförpackningen, försegla foliepåsen med dragkedja och återgå till 2~8℃ så snart som möjligt efter användning.Andra reagenser bör återställas till 2~8℃ så snart som möjligt efter användning.

Material som krävs men medföljer inte

1. Mikroplattläsare med 450±10nm filter (bättre om den kan detektera vid 450 och 650 nm våglängder).

2. Skakare för mikroplattor.

3. RNasfria spetsar och centrifugrör.

Operation Flödesschema

Innan du börjar

1. Låt alla kitkomponenter och prover komma till rumstemperatur (18-25 ℃) före användning.Om kitet inte kommer att användas på en gång, ta endast ut remsor och reagenser för det aktuella experimentet och lämna de återstående remsorna och reagenserna i önskat skick.

2. Tvättbuffert: späd 40mL 20x koncentrerad tvättbuffert med 760mL avjoniserat eller destillerat vatten för att framställa 800mL 1x tvättbuffert.

3. Standard: centrifugera eller centrifugera kort stamlösningen före användning.Koncentrationen av fyra standarder som tillhandahålls är 5ng/μL.För UTP- och pUTP-dsRNA-standarder, späd stamlösningen till 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 pg/μL med STE-buffert för att rita standardkurvan.För N1-Me-pUTP dsRNA-standarder, späd stamlösningen till 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL med STE-buffert för att rita standardkurvan.För 5-OMe-UTP dsRNA-standard, späd stamlösningen till 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL med STE-buffert för att rita standardkurvan.Vi rekommenderar att standarder kan spädas ut enligt följande diagram:

4. Biotinylerad detektionsantikropp och HRP-streptavidin arbetslösning: snurra kort eller centrifugera stamlösningen före användning.Späd dem till arbetskoncentrationen med spädningsbuffert.

5. TMB-substat: aspirera den nödvändiga dosen av lösningen med steriliserade spetsar och dumpa inte kvarvarande lösning i flaskan igen.TMB-substaten är känslig för ljus, exponering inte TMB-substratet för ljus under lång tid.

Använder protokoll

1. Bestäm antalet remsor som krävs för analysen.Sätt in remsorna i ramarna för användning.Återstående plattremsor som inte används i denna analys bör packas om i påsen med torkmedel.Stäng påsen ordentligt för kylförvaring.

2. Tillsätt 100 μL vardera av spädningarna av standard, blankprov och prover i lämpliga brunnar.Täck med plattförseglaren.Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur med skakning vid 500 rpm.Proverna ska spädas med STE-buffert till lämplig koncentration för noggrann analys.

3. Tvättsteg: Aspirera lösningen och tvätta med 250μL tvättbuffert till varje brunn och låt den stå i 30 sekunder.Kassera tvättbuffert helt genom att fästa plattan på absorberande papper.Tvättas totalt 4 gånger.

4. Tillsätt 100 μL arbetslösning för biotinylerad detektionsantikropp i varje brunn.Täck med plattförseglaren.Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur med skakning vid 500 rpm.

5. Upprepa tvättsteget.

6. Tillsätt 100 μL HRP-streptavidin arbetslösning i varje brunn.Täck med plattförseglaren.Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur med skakning vid 500 rpm.

7. Upprepa tvättsteget igen.

8. Tillsätt 100 μL TMB-substratlösning i varje brunn.Täck med plattförseglaren.Inkubera i 30 minuter vid RT. Skydda från ljus.Vätskan blir blå genom tillsats av substratlösning.

9. Tillsätt 50 μL stopplösning i varje brunn.Vätskan blir gul genom tillsats av stopplösning.Kör sedan mikroplattläsaren och utför mätningen vid 450 nm omedelbart.

Beräkning av resultat

1. Ta ett medelvärde för de dubbla avläsningarna för varje standard, kontroll och prover och subtrahera den genomsnittliga optiska standarddensiteten på noll.Konstruera en standardkurva med absorbans på den vertikala (Y)-axeln och dsRNA-koncentration på den horisontella (X)-axeln.

2. Det rekommenderas att utföra beräkningen med datorbaserad kurvanpassningsmjukvara såsom kurvexpert 1.3 eller ELISA Calc i en icke-linjär modell med 5 eller 4 parametrar.

Prestanda

1. Känslighet:

nedre detektionsgräns: ≤ 0,001 pg/μL (för UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (för 5-OMe-UTP-dsRNA).

nedre gräns för kvantifiering: 0,0156 pg/μL (för UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (för N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (för 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precision: CV för Intra-analys ≤10 %, CV för Inter-Assay ≤10 %

3. Återhämtning: 80%~120%

4.Linjäritet:0,0156-0,5pg/μL(förUTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1pg/μL(förN1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1pg/μL(för 5-OMe-UTP-dsRNA).

Överväganden

1. TMB reaktionstemperatur och tid är kritisk, kontrollera dem strikt enligt instruktionerna.

2. För att uppnå god analysreproducerbarhet och känslighet är det viktigt att plattorna tvättas ordentligt för att avlägsna överskott av oreagerade reagens.

3. Alla reagenser ska blandas noggrant före användning och undvik skum under prov- eller reagenstillsats.

4. Om det har bildats kristaller i den koncentrerade tvättbufferten (20x), värm till 37 ℃ och blanda försiktigt tills kristallerna är helt upplösta.

5. Undvik analys av prover som innehåller natriumazid (NaN3), eftersom det kan förstöra HRP-aktiviteten vilket resulterar i underskattning av mängden dsRNA.

6. Undvik RNas-kontamination under analysen.

7. Standarden/provet, detektionsantikroppen och SA-HRP kan också utföras vid RT utan att skaka, men detta kan leda till att detektionskänsligheten minskar en gånger.I det här fallet rekommenderar vi att UTP- och pUTP dsRNA-standarder späds från 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA-standarder ska spädas från 4pg/μL och 5-OMe-UTP dsRNA-standard ska spädas från 8pg/μL.Inkubera dessutom HRP-streptavidin arbetslösning i 60 minuter vid rumstemperatur.Använd inte kolvskakare, eftersom kolvskakare kan resultera i felaktiga resultat.

Typiskt resultat

1. Standardkurvdata

2. Standardkurvberäkning

3. Liner detektionsområde: 0,0312- 1pg/μL