DNA Extraction Mini Kit
Detta kit använder optimerat buffertsystem och silikagelkolonnreningsteknologi, som kan återvinna 70 bp – 20 kb DNA-fragment från olika koncentrationer av TAE eller TBE agarosgel.DNA-adsorptionskolonn kan speciellt adsorbera DNA under högsalttillstånd.Dessutom kan kitet direkt rena DNA-fragment från PCR-produkter, enzymatiska reaktionssystem eller råa DNA-produkter erhållna med andra metoder, och ta bort föroreningar som proteiner, andra organiska föreningar, oorganiska saltjoner och oligonukleotidprimrar.Det kan säkerställa att reningen kan slutföras inom 10-15 min.Det renade DNA:t kan användas direkt för ligering, transformation, enzymklyvning, in vitro-transkription, PCR, sekvensering, mikroinjektion, etc.
Förvaringsförhållanden
Förvara vid -15 ~ -25 ℃ och transportera i rumstemperatur.
Komponenter
| Komponenter | (100 rxns) |
| Buffert BNP | 80 ml |
| Buffert GW | 2 × 20 ml |
| Elueringsbuffert | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Buffert BNP:DNA-bindande buffert.
Buffert GW:Tvättbuffert;tillsätt absolut etanol med den angivna volymen på flaskan före användning.
Elueringsbuffert:Eluering.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNA-adsorptionskolonner.
Uppsamlingsrör 2 ml:Uppsamlingsrör för filtrat.
Förberedda material
1,5 ml steriliserade rör, absolut etanol och isopropanol (när DNA-fragment ≤100 bp, tillsätt 1 volym
isopropanol till 1 volym gel), vattenbad.
Experimentprocess
Tillsätt 80 ml etanol för att späda buffert GW enligt anvisningarna på etiketten före användning, förvara i rumstemperatur.
Mekanism
1. PCR-reaktionslösning
Gelextraktionsschema: Tillsätt lika volym Buffer GDP PCR-reaktionslösningsåtervinningsschema:Lägg till 5 gånger volymbufferten
2. BNP Beräkna volymen gel(100 μl är lika med 100 mg)
Lös upp gelen
3. Förvärm till 50 ~ 55℃
4. Bind tvätt
Lägg till 300 μL buffert-BNP*
Tillsätt 700 μL buffert GW
Tillsätt 700 μL buffert GW
5. Eluera
Tillsätt 20 – 30 μL elueringsbuffert eller avjoniserat vatten
Anmärkningar* PCR-reaktionsvätskeåtervinning utan detta steg
Gelextraktionsprogram
1. Efter DNA-elektrofores för fraktionering av DNA-fragment, skär ut den enda remsan av DNA-fragment från agarosgelen under UV-ljus.Det rekommenderas att använda absorberande papper för att absorbera skenbar fukt från gelen och minimera storleken på gelskivan genom att ta bort extra agaros som möjligt.Väg gelskivan (utan mikrocentrifugrör) för att beräkna dess volym: Volymen på 100 mg gelskiva är cirka 100 μL, förutsatt att densiteten är 1 g/ml.
2. Tillsätt lika stor volym Buffer GDP, inkubera vid 50~55 ℃ i 7-10 minuter (enligt gelstorleken, justera inkubationstiden tills gelén är helt upplöst).Vänd på röret 2 gånger under inkubationen.
Δ Tillsats av 1-3 volymer Buffer GDP kommer inte att påverka effektiviteten av DNA-återvinningen.Om DNA-fragmentet som ska återvinnas <100 bp, måste 3 volymer Buffer GDP tillsättas;när gelskivan har lösts upp helt, tillsätt 1 volym isopropanol och blanda noggrant, fortsätt sedan till nästa steg.
3. Centrifugera kort för att föra provet till botten av röret, sätt in FastPure DNA Mini Columns-G i uppsamlingsrören 2 ml, överför försiktigt lösningen maximalt 700 μL en gång per
tid till filtreringskolonnerna, centrifugera vid 12 000 rpm (13 800 X g) i 30-60 sek.
4. Kassera filtratet och tillsätt 300 μL Buffer GDP till kolonnen, inkubera vid rumstemperatur i 1 min, centrifugera vid 12 000 rpm (13 800 X g) i 30-60 sekunder.
5. Kassera filtratet och tillsätt 700 μL buffert GW (kontrollera om absolut etanol har tillsatts i förväg!) till kolonnen, centrifugera vid 12 000 rpm (13 800 X g) i 30-60 sekunder.
Δ Vänligen tillsätt Buffer GW runt adsorptionskolonnens vägg, eller lägg till Buffer GW-bakstycket och blanda det upp och ner i 2 – 3 gånger för att helt spola saltet som fäster på rörväggen.
6. Upprepa steg 5.
Δ Spolning med buffert GW två gånger kan säkerställa att saltet avlägsnas helt och eliminera påverkan på efterföljande experiment.
7. Kassera filtratet och centrifugera den tomma kolonnen vid 12 000 rpm (13 800 X g) i 2 minuter.
8. Sätt in kolonnen i ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 20 - 30 μL elueringsbuffert till mitten av kolonnmembranet, inkubera i 2 minuter och centrifugera sedan vid 12 000 rpm (13 800 X g) i 1 min.Kassera kolonnen, lagra erhållet DNA vid -20°C.
Δ Överföring av supernatanten från steg 8 till kolonnen för att eluera igen och förvärmning av elueringsbufferten till 55 (när DNA-fragment >3 kb) kan vara till hjälp för att öka återvinningseffektiviteten.
Återställningsprogram för PCR-produkter
Detta protokoll är tillämpligt för att rena DNA-fragment från PCR-produkter, enzymatiska reaktionssystem och andra DNA-råprodukter (inklusive genetiskt DNA).Denna lösning kan effektivt avlägsna olika nukleotider, primers, primer-dimerer, saltmolekyler, enzymer och andra föroreningar.
1. Centrifugera kort PCR-produkter, enzymatisk reaktionslösning och andra DNA-råprodukter.Uppskatta deras volym med pipett och överför till ett steriliserat 1,5 ml eller 2 ml rör.Tillsätt ddH2O tills volymen är upp till 100 μL;medan för genomiskt DNA med hög koncentration, spädning till 300 μL med ddH2O kommer att bidra till att förbättra återhämtningseffektiviteten.
2. Tillsätt 5 volymer Buffer GDP, blanda noggrant genom att vända eller vortexa.Om DNA-fragment av intresse >100 bp måste ytterligare 1,5 volymer (prover + buffert-BNP) etanol tillsättas.
3. Sätt tillbaka kolonnen i uppsamlingsröret, överför blandningen till kolonnen, centrifugera vid 12 000 rpm (13 800 × g) i 30 – 60 sek.Om volymen av den blandade lösningen är >700 µL, sätt tillbaka adsorptionskolonnen i uppsamlingsröret, överför den återstående lösningen till adsorptionskolonnen och centrifugera vid 12 000 rpm (13 800 × g) i 30 – 60 sek.
4. Nästa prestation hänvisar till steg 5 – 8 i 08- 1/Gelextraktionsprogrammet.
Ansökningar
Olika koncentrationer av TAE eller TBE agarosgel;PCR-produkter, enzymatiska reaktionssystem eller andra råa DNA-produkter erhållna med olika metoder.Återvunna fragment varierade från70 bp -20 kb.
Anteckningar
Endast för forskningsanvändning.Ej för användning i diagnostiska procedurer.
1. Tillsätt 80 ml etanol för att späda ut buffert GW som anges på etiketten före användning, förvara i rumstemperatur.
2. Om buffertens BNP är lätt att fälla ut vid lågtemperaturlagring kan den placeras i rumstemperatur under en tid före användning.Om det behövs kan det förvärmas i ett 37℃ vattenbad tills fällningen är helt upplöst, och sedan kan den användas efter blandning.
3. Ställ in vattenbadstemperaturen till 50 ~55℃ i förväg.
4. I 08-1/Gel extraktionsprogrammet steg 1, kommer minimering av storleken på gelskivan att minska upplösningstiden avsevärt och öka återhämtningseffektiviteten (lineariserat DNA är lätt att hydrolysera när det kontinuerligt exponeras vid hög temperatur).Utsätt inte DNA-gelen för UV under lång tid, eftersom ultraviolett ljus kan orsaka DNA-skador.
5. Lös upp gelén i 08-1/Gelextraktionsprogram steg 2 helt, annars kommer DNA-återvinningseffektiviteten att påverkas allvarligt.
6. Förvärm elueringsbuffert eller ddH2O till 55 ℃, vilket är användbart för att förbättra effektiviteten av DNA-elueringen.Det rekommenderas att lagra DNA i eluent av 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
